KlenThermase DNA Polymerase
Модифицированная термостабильная ДНК-полимераза на основе Taq, оптимизированная для микросеквенирования (minisequencing, Single-Base Extension, SBE), включая SNP-генотипирование, и являющаяся ферментом выбора для данного метода.
Микросеквенирование (SBE) и секвенирование по Сэнгеру требуют разных условий.
Условия реакции подбирают индивидуально под каждый метод, следуя стандартным лабораторным
протоколам. Некоторые протоколы подробно описаны в приведенных публикациях.
Условия реакции подбирают индивидуально под каждый метод, следуя стандартным лабораторным
протоколам. Некоторые протоколы подробно описаны в приведенных публикациях.
НАЗНАЧЕНИЕ:
• Микросеквенирование (minisequencing, Single-Base Extension, SBE)
• SNP-генотипирование
• Циклическое секвенирование ДНК (по Сэнгеру)
• Автоматизированное флуоресцентное секвенирование ДНК
• Ручное секвенирование ДНК с радиоактивной меткой
Используется в ручных и автоматизированных протоколах секвенирования, включая методы с радиоактивной меткой (например, 35S), и циклическое секвенирование с флуоресцентными
терминаторами, где требуется контролируемая терминация цепи и высокая точность включения нуклеотидов.
• Микросеквенирование (minisequencing, Single-Base Extension, SBE)
• SNP-генотипирование
• Циклическое секвенирование ДНК (по Сэнгеру)
• Автоматизированное флуоресцентное секвенирование ДНК
• Ручное секвенирование ДНК с радиоактивной меткой
Используется в ручных и автоматизированных протоколах секвенирования, включая методы с радиоактивной меткой (например, 35S), и циклическое секвенирование с флуоресцентными
терминаторами, где требуется контролируемая терминация цепи и высокая точность включения нуклеотидов.
Одна единица (U) определяется как количество фермента, включающее до 10 нмоль dNTP в
кислотонерастворимую форму за 30 минут при 72 °C в среде с 25 мМ TAPS (натриевая соль), pH 9,3 (при 25°C),
50 мМ KCl, 2 мМ MgCl2, 1 мМ β-меркаптоэтанола и активированной ДНК тимуса теленка в качестве субстрата.
кислотонерастворимую форму за 30 минут при 72 °C в среде с 25 мМ TAPS (натриевая соль), pH 9,3 (при 25°C),
50 мМ KCl, 2 мМ MgCl2, 1 мМ β-меркаптоэтанола и активированной ДНК тимуса теленка в качестве субстрата.
Фермент также используется для секвенирования по Сэнгеру с применением
дидезоксинуклеотидов (ddNTP). Мутации в активном центре повышают специфичность и точность включения dNTP и ddNTP.
Источник:
рекомбинантный белок, выделенный из штамма E.coli, экспрессирующего модифицированный ген Taq ДНК-полимеразы из Thermus aquaticus.
Буфер хранения:
50 мМ Трис-HCl, 100 мМ NaCl, 0,5 мМ ЭДТА, 1 мМ ДТТ, 0,01% Tween 20, 50% (v/v)
глицерин, (pH 7,5 при 25°C)
Реакционный буфер 5Х (без Mg2+):
pH 8,8 при 25 °C. MgCl2 добавляется отдельно.
дидезоксинуклеотидов (ddNTP). Мутации в активном центре повышают специфичность и точность включения dNTP и ddNTP.
Источник:
рекомбинантный белок, выделенный из штамма E.coli, экспрессирующего модифицированный ген Taq ДНК-полимеразы из Thermus aquaticus.
Буфер хранения:
50 мМ Трис-HCl, 100 мМ NaCl, 0,5 мМ ЭДТА, 1 мМ ДТТ, 0,01% Tween 20, 50% (v/v)
глицерин, (pH 7,5 при 25°C)
Реакционный буфер 5Х (без Mg2+):
pH 8,8 при 25 °C. MgCl2 добавляется отдельно.
KlenThermase™ не обладает 5’→3’ и 3’→5’ экзонуклеазной активностью, что обеспечивает контролируемую терминацию цепи и высокую точность инкорпорации нуклеотидов в реакциях секвенирования. Селективность достигается за счёт особенностей включения нуклеотидов, а не корректирующей активности.
Реакция характеризуется высоким сигналом, низким фоном и равномерной интенсивностью пиков.
Используется в ручных и автоматизированных протоколах секвенирования, включая методы с радиоактивной меткой (например, 35S), и циклическое секвенирование с флуоресцентными терминаторами, где требуется контролируемая терминация цепи и высокая точность включения
нуклеотидов.
Реакция характеризуется высоким сигналом, низким фоном и равномерной интенсивностью пиков.
Используется в ручных и автоматизированных протоколах секвенирования, включая методы с радиоактивной меткой (например, 35S), и циклическое секвенирование с флуоресцентными терминаторами, где требуется контролируемая терминация цепи и высокая точность включения
нуклеотидов.
- Оптимизирована для микросеквенирования (Single-Base Extension, SBE)
- Высокая дискриминация mismatch на 3’-конце праймера
- Отсутствие 5’→3’ и 3'→5' экзонуклеазной активности
- Оптимизированное включение ddNTP (для секвенирования)
- Обеспечивает контролируемую терминацию цепи и высокую точность
- Улучшенное соотношение сигнал/фон по сравнению с классической Thermo SequenaseTM.
ОСНОВНЫЕ СВОЙСТВА
- 5’→3’ ДНК-полимеразная активность. Обеспечивает эффективный синтез ДНК в стандартных условиях ПЦР и реакциях удлинения праймера. Длина амплифицируемых фрагментов — до 1,5 kb, что покрывает диапазон, оптимальный для секвенирования по Сэнгеру (100–1000 п.н.), и подходит для амплификации перед определением последовательности.
- Отсутствие 5’→3’ экзонуклеазной активности. Фермент не разрушает ДНК впереди синтезируемой цепи, что делает его оптимальным для циклического секвенирования и реакций удлинения праймеров.
- Отсутствие 3’→5’ экзонуклеазной активности (proofreading). Критически важно для секвенирования: предотвращает удаление ddNTP с 3'-конца. Фермент не обладает корректирующей активностью, повышенная точность обусловлена мутациями в активном центре.
- Оптимизированное включение dNTP и ddNTP обеспечивает равномерную интенсивность сигналов и воспроизводимость результатов.
- Повышенная специфичность и точность инкорпорации. Позволяет эффективно дискримикроровать некомплементарные основания (mismatch) на 3’-конце праймера, что делает фермент эффективным для SNP-генотипирования и реакций удлинения праймера.
- Низкий уровень фоновой амплификации. Улучшает читаемость электрофореграмм и повышает надежность интерпретации результатов.
- Оптимум активности 70–74 °C. Соответствует стандартным условиям удлинения в реакциях секвенирования и ПЦР.
- Терминальная трансферазная активность (A-overhang). Фермент добавляет преимущественно один A-выступ на 3’-конце ДНК. Это свойство не влияет на качество секвенирования и позволяет использовать фермент в реакциях удлинения и модификации концов ДНК. Отсутствие экзонуклеазных активностей (exo–) делает KlenThermaseTM пригодным для применения в задачах подготовки NGS-библиотек (например, при пришивке адапторов).
Хранение и транспортировка:
от -20°C до -18°C
Срок годности:
2 года с даты поставки.
Только для научно-исследовательских целей.
Не предназначено для терапевтического или диагностического использования.
от -20°C до -18°C
Срок годности:
2 года с даты поставки.
Только для научно-исследовательских целей.
Не предназначено для терапевтического или диагностического использования.